Скальпелем выполняют небольшой поверхностный надрез в пределах очага поражения (в краевой части) и с краёв раны соскабливают кусочки ткани вместе с тканевой жидкостью. Собранный материал переносят на предметное стекло, где равномерно распределяют по поверхности. Впоследствии препарат фиксируют метиловым спиртом (смесью Никифорова), высушивают при комнатной температуре и окрашивают по Романовскому-Гимзе. Препарат микроскопируют, начиная с малого увеличения (объектив х10), затем переводят на большее увеличение (объектив х40), далее используют иммерсию (объектив х100 – иммерсионный). В препаратах возбудитель кожного лейшманиоза имеет вид вытянутых или овальных телец, в цитоплазме которых обнаруживают два ядра – трофическое (окрашивается в красный или красно-фиолетовый цвет) и двигательное (тёмно-фиолетового цвета). Цитоплазма лейшманий имеет светло-голубой цвет.
Отмечается выраженный акантоз эпидермиса, к которому вплотную примыкает полиморфный инфильтрат, состоящий из макрофагов, гистиоцитов и небольшого количества нейтрофилов. Характерна выраженная сосудистая реакция, заключающаяся в пролиферации и набухании эндотелия, приводящая к значительному сужению просвета сосудов. Лейшмании обнаруживаются в большом количестве как вне, так и внутриклеточно, преимущественно в макрофагах (тельца Лейшмана – Донована). В более поздних стадиях количество макрофагов и возбудителей уменьшается и развивается грануломатозный инфильтрат, состоящий из эпителиоидных и многоядерных гигантских клеток. Гистологическая картина очагов поражения при туберкулоидном кожном лейшманиозе не отличается от туберкулезной волчанки.
Основан на данных анамнеза (пребывание эндемичном по кожному лейшманиозу регионе), клинической картине заболевания и положительных результатах микроскопии отделяемого с поверхности лейшманиом, иногда прибегают к гистологическому исследованию.