Уровень 1
Уровень 2
Уровень 3
Уровень 4
Уровень 5
Уровень 6

Устройство микроскопа

Сложно точно сказать, кто первым изобрёл микроскоп, поскольку увеличительные свойства наполненных водой стеклянных сосудов были известны ещё древним римлянам. Называют имена голландского мастера очков Захария Янсена, итальянского врача Джероламо Фракасторо, Галилео Галилея, Корнелиуса Дреббеля, Кристиана Гюйгенса, Роберта Гука, однако Антони Ван Левенгуку (1632-1723) первому удалось создать микроскоп с очень сильной линзой, которая давала увеличение в 300 раз, благодаря чему он смог привлечь к своему изобретению внимание биологов, врачей и других исследователей.

Подробнее об изобретении Левенгука можно узнать здесь



Микроскоп предназначен для наблюдения увеличенного изображения мелких объектов с высокой разрешающей способностью. Наиболее распространенным является тип микроскопа проходящего света, традиционно называемый биологическим микроскопом. С его помощью можно рассматривать помещенные на предметном столике препараты с прозрачными или полупрозрачными объектами, окрашенными (или неокрашенными). Классическая конструкция современного биологического (медицинского) микроскопа сложилась во второй половине ХХ века. Оптическая система микроскопа имеет две основные ступени увеличения посредством объектива и окуляра.

Объектив образует действительное перевёрнутое изображение препарата в промежуточной плоскости, лежащей вблизи переднего фокуса окуляра.

Окуляр работает подобно лупе и образует вторично увеличенное мнимое изображение, которое расположено от глаза наблюдателя на расстоянии наилучшего видения. Такой микроскоп даёт увеличенное перевёрнутое изображение препарата.

Видимое увеличение микроскопа

Под увеличением микроскопа принято понимать отношение размера изображения объекта на сетчатке глаза, образованного при наблюдении в микроскоп, к размеру изображения того же объекта, полученного на сетчатке при наблюдении невооружённым глазом. Поэтому увеличение микроскопа при наблюдении в окуляр называют видимым увеличением.

Видимое увеличение микроскопа Гм определяется по формуле:

Гм = βоб х βпр х Гок или Гм = βоб х Гок

где:

βоб – значение увеличения объектива,
βпр – увеличение промежуточной системы, часто равное 1,
Гок  – видимое увеличение окуляра.

Числовая апертура

Числовая апертура объектива определяется при конструировании объектива и составляет:

A=n sinα ,

где: 

n – показатель преломления имерсионной среды объектива,
α – апертурный угол объектива

Под апертурным углом α понимается половина максимального пространственного угла, под которым оптическая система (объектив) позволяет рассматривать исследуемый объект.

Иногда числовую апертуру оптической системы записывают как: NA, подчеркивая необходимость учета наличия иммерсионной среды с показателем преломления N.

Разрешающая способность

Разрешающая способность микроскопа является одним из главных его свойств. Под разрешающей способностью микроскопа понимается способность оптической системы различить две близко расположенные на объекте точки как раздельные. Вследствие дифракционных особенностей любой точечный объект при увеличении с помощью микроскопа становится размытым, и изображение точки перекрывается с изображением соседнего объекта. По дифракционной теории изображения Аббе, предел разрешения микроскопа составляет:

R = 0,61λ/n sinα ,

где: 

λ – длина волны света, 
n – показатель преломления имерсионной среды объектива, 
α – апертурный угол объектива.

Как видно из выражения, разрешение зависит от длины волны света λ и от числовой апертуры объектива. Чем выше числовая апертура, тем лучше разрешение.

Числовая апертура объектива, не имеющего иммерсии, не превышает 1,0, поэтому предельная разрешающая способность такого объектива будет более 0,3 мкм (при λ=550 нм).

Для иммерсионного объектива с апертурой А=1,5 предельная разрешающая способность составит 0,2 мкм. Это значение приближается к предельному разрешению световой микроскопии. В современных системах анализа изображения разрешение зависит не только от оптических возможностей системы. Дополнительные преобразования оптического сигнала в электрический (цифровой) и снова в оптический на экране монитора способствуют ухудшению разрешения системы в целом. Расширить границы разрешения позволит только применение новых специальных технологий регистрации изображений.

Полезное увеличение

По существующему эмпирическому правилу – для достижения в микроскопе максимального разрешения общее увеличение микроскопа при визуальных наблюдениях должно находиться в диапазоне:

500 А < Г < 1000 А

Приведенное соотношение называют полезным увеличением. Применение увеличения менее 500А не даёт возможности различить все тонкости структуры объекта, которые может дать объектив с данной апертурой, так как предел разрешения глаза в этом случае меньше, чем у микроскопа. Увеличение, превышающее 1000А, не позволяет выявить новые детали в изображении, по сравнению с теми, какие различаются при полезном увеличении.

Глубина резкости

Значение числовой апертуры определяет еще одно из главных свойств микроскопа  глубину резкого изображения.

Глубина резкого изображения – это расстояние, на которое перемещается объект относительно объектива, без видимого ухудшения резкости изображения, и может быть определено, как:

Тв =λ /2 А2

Значение глубины резкости (волновая составляющая) обратно пропорционально квадрату числовой апертуры объектива. Этот факт необходимо учитывать при использовании в ходе исследования объективов разных увеличений.

При переходе от объективов малого увеличения (4х, 10х), которыми было сфокусировано изображение, к объективу 100х возможна потеря плоскости изображения, если не выполнить фокусировку объективами промежуточных увеличений.

Конструкция микроскопа

Конструирование современных микроскопов ведется с соблюдением принципа модульности и унификации составляющих узлов. Этот принцип соблюдается как внутри фирм производителей, а по ряду узлов, и между фирмами различных стран.

Основными механическими узлами микроскопов являются штатив, револьверное устройство для размещения и фиксации объективов, фокусировочный механизм, предметный столик с препаратодержателем и устройством перемещения объекта.

Штатив 3 (рисунок 1) является несущим элементом для крепления на нём всех частей микроскопа, часто штатив выполняется как единый узел с основанием 7.

Револьверное устройство 2 предназначено для быстрого изменения увеличения микроскопа путём смены объектива. Устройство является точным механизмом, обеспечивающим парфокальность и парацентричность объективов, устанавливаемых в фиксированное положение.

Револьверные устройства различаются по количеству гнёзд для установки объективов (от 4-х до 6) и направлению наклона от штатива или к штативу. Последний вариант предпочтительнее, так как освобождает пространство для установки препаратов. Фокусировочный механизм, как правило, в двухступенчатом исполнении обеспечивает возможность грубого и точного перемещения предметного столика в вертикальном направлении. Управление осуществляется соответствующими рукоятками 5, расположенными на одной оси (коаксиальными) по обеим сторонам штатива.


Рис. 1. Устройство микроскопа.

Предметный столик микроскопа 10 служит для размещения на нём объекта наблюдения и перемещения его в горизонтальной плоскости. Наибольшее распространение получили двухкоординатные предметные столики с препаратодержателем и препаратоводителем. Перемещение препарата осуществляется коаксиальными рукоятками 4, управляемыми, как правило, правой рукой. Рукоятки фокусировочного механизма и предметного столика располагают по возможности низко для удобного положения руки при работе на микроскопе.

Препаратодержатель выполняют для одного или двух стандартных предметных стекол размерами 76х26 мм при толщине стекла 1±0,1 (ГОСТ 9284).

Основными оптическими узлами микроскопов являются объективы 11, окуляры 12, а также элементы систем освещения и наблюдения.

Объективы

Главным узлом, определяющим качество изображения в оптической системе микроскопа, является объектив. Основные классы объективов по коррекции аберраций оптических систем это: ахроматы, апохроматы, планахроматы, планапохроматы.

Ахроматы – класс наиболее простых объективов, у которых исправлен хроматизм положения для двух цветов. Принадлежность к классу ахромат на корпусе объектива не отражается.

Апохроматы – класс объективов с более высоким уровнем коррекции хроматизма положения, на корпусе надпись “АПО”, “APO”.

Планахроматы – ахроматические объективы с исправленной кривизной поля, на корпусе надпись “ПЛАН” или “PLAN”.

Планапохроматы – класс наиболее трудоёмких и дорогих объективов апохроматической коррекции с плоским полем изображения. На корпусе надпись “ПЛАНАПО” или “PLAN-APO”. Объективы используются в системах регистрации изображения.

Кроме указанных основных классов объективов, фирмы-производители изготавливают объективы с несколько отличной степенью коррекции. В частности, полупланахроматы (стигмахроматы) – класс ахроматических объективов с исправленной (~2/3) кривизной поля, на корпусе надпись “СХ”, “Semi PLAN”. Согласно международным стандартам на объективах всех конструкций, кроме указанного типа коррекции, приводятся еще несколько характеристик.

Пример надписи на корпусе объектива 40х/0,65 /0,17.

Надпись означает, что объектив принадлежит к классу ахроматов, имеет линейное увеличение 40х, числовую апертуру 0,65, рассчитан в системе тубуса “бесконечность” для работы с покровным стеклом толщиной 0,17мм.

Надпись 40х/0,65 160/0 означает, что объектив имеет конечную длину тубуса 160 мм и рассчитан для работы без покровного стекла.

П р и м е ч а н и е Длина тубуса (конечная 160, 190 мм или “бесконечность”) конструктивный параметр микроскопа, соответствующий расстоянию от опорного торца объектива до плоскости промежуточного изображения.

Все чаще в биологических микроскопах применяются объективы, оптическая длина тубуса которых “бесконечность”. В этом случае объект помещается в передней фокальной плоскости объектива и после объектива выходит параллельный пучок лучей. Из “бесконечности” изображение проецируется в промежуточную плоскость тубусной линзой. Если объектив обеспечивает работу с объектом, защищенным покровным стеклом и без него, в надписи на корпусе вместо толщины стекла будет “”.

Например, 4х/0,1 160/ или 100х/1,25 МИ /

Используемая с объективом масляная иммерсия записывается как: “OIL” или “МИ”; “ВИ” или “W” означает водную иммерсию.

Покровные стёкла для препаратов по (ГОСТ 6672) выпускаются размерами – 19х18 и 24х24 мм при толщине () мм. Значение толщины применяемого покровного стекла влияет на качество изображения. Отклонение толщины на 0,01 мм обеспечивает приемлемое качество изображения для сухих объективов, имеющих числовую апертуру A=0,45 и выше. Отклонение толщины на 0,03 мм допустимо для объективов, имеющих апертуру в пределах 0,3-0,45. Большие отклонения приводят к появлению сферической аберрации и ухудшению качества изображения. Объектив масляной иммерсии при указании толщины покровного стекла “0,17” допускает работу с препаратом без покровного стекла, т.к. значения показателей преломления масла и стекла близки.

Высота современных объективов (или парфокальная высота), т. е. расстояние от опорного торца объектива до плоскости объекта, в основном составляет 45 мм, однако существуют модели микроскопов с другой высотой объективов, например, 60 мм. В правильно собранном микроскопе должно соблюдаться условие, при котором смена увеличения объектива не должна приводить к расфокусировке изображения с полной потерей контуров.

Реализация возможности микроскопа в получении качественного изображения зависит от всех его компонентов. Объектив играет в этом основную роль, однако, без правильно подобранных систем освещения и наблюдения получить требуемое качество изображения невозможно.

Система наблюдения

Наблюдение объектов осуществляется с помощью бинокулярной насадки 1, устанавливаемой на верхнем срезе штатива. Бинокулярные насадки оснащаются системой регулировки расстояния между осями окулярных тубусов 55 – 75 мм в соответствии с глазной базой наблюдателя. Для компенсации аметропии наблюдателя (близорукость, дальнозоркость) на левом окулярном тубусе устанавливается диоптрийная подвижка в пределах ± 5 дптр. Для фото- или видеопроекции бинокулярные насадки оснащаются дополнительным (вертикальным) выходом, который используется для установки системы (адаптера), согласующей подключение камеры. Насадки с дополнительным выходом называют тринокулярными.

Конструкция бинокулярной насадки  сложное оптико-механическое устройство, позволяет естественную для пользователя возможность наблюдения двумя глазами, но обеспечение такой возможности требует строго выполнения очень значимого требования  соблюдения параллельности осей лучей, выходящих из окуляров бинокулярных тубусов. Проверка параллельности осей лучей, выходящих из окуляров, и необходимая при этом регулировка требуют наличия специального производственного оборудования. Необходимо заметить, что на короткое время глаза могут адаптироваться к непараллельности осей, однако, работа на таких микроскопах неизбежно приводит к быстрой утомляемости, а при постоянной работе к ухудшению зрения. При выборе микроскопов для покупки необходимо ориентироваться на гарантии качества фирмы-производителя. Вместо бинокулярной системы наблюдения в некоторых микроскопах еще применяются монокулярные насадки.

Окуляры

Как известно окуляр работает подобно лупе и образует увеличенное мнимое изображение, которое расположено от глаза наблюдателя на расстоянии наилучшего видения. Основные характеристики окуляра  увеличение и линейное поле зрения. Произведение значения увеличения окуляра на величину линейного поля называется окулярным числом. Окуляр относится к категории обычных, если окулярное число менее 180, при числе более 180 окуляр считается широкоугольным (широкопольным). В современных микроскопах наибольшее распространение получили широкоугольные окуляры 10х/18, и 10х/20, т.е. окуляры увеличением 10 и полем зрения в пространстве изображения 18 (или 20) мм, обозначаемые как «WF». Существуют системы сверх широкоугольных окуляров 10х/22, 10х/25, обозначаемых как «WWF».

В современном микроскопе, как правило, объективы не требуют от окуляров компенсации хроматических аберраций, наличие которой в окуляре обозначалось «К».

Окуляры, предназначенные для работы с планобъективами, обозначают: «PL» или «Plan». Положение переднего фокуса окуляра (плоскость промежуточного изображения) относительно опорной поверхности окулярного тубуса составляет в основном 10 мм.

Для целей морфологических оценок размеров структур выпускаются окуляры со шкалами и сетками. Такие окуляры снабжаются механизмом диоптрийной подвижки глазной линзы для фокусировки на плоскость шкалы. Существуют конструкции окуляров с удаленным (до 20 мм) положением выходного зрачка, предназначенные для работы в очках.

Посадочные диаметры окуляров стандартизованы. Для окуляров с полем зрения до 20 мм диаметр корпуса составляет 23,2 мм, окуляры с полем зрения более 20 мм имеют диаметр 30 мм.

Система освещения (метод светлого поля)

Важное значение для получения в микроскопе равномерно освещенного контрастного изображения объектов имеет его осветительная система. В современных микроскопах освещение по наиболее принятому методу светлого поля осуществляется с соблюдением принципа Келера, как наиболее эффективного способа освещения объекта.

Принцип Келера предусматривает наличие в микроскопе двух систем сопряженных плоскостей полевых и апертурных. Полевая диафрагма 8 проецируется в плоскость объекта и ограничивает поле зрения на препарате, ее изображение наблюдается в плоскости изображения объекта, рассматриваемой окуляром.

Апертурная диафрагма устанавливается в плоскости изображения источника света и ограничивает угол освещающих лучей (апертурный угол) в конденсоре 9, проекция апертурной диафрагмы наблюдается в выходном зрачке объектива.

Система освещения микроскопа располагается в основании микроскопа, фонарь 6 с источником света для лучшего охлаждения выносится за пределы штатива.

Во всех конструкциях микроскопов полевая и апертурная диафрагмы – ирисовые, с регулируемым диаметром отверстия и позволяют независимо изменять угол освещения и поле зрения.

В современных микроскопах для удобного пользования узел ирисовой полевой диафрагмы размещают под конденсором. Перемещением конденсора по высоте изображение диафрагмы фокусируется в плоскости объекта, центрирование изображения диафрагмы  подвижкой конденсора в плоскости, перпендикулярной визирной оси.

Наиболее типичным для биологического микроскопа является конденсор Аббе, имеющий числовую апертуру 0,9 (и 1,25 при нанесении масляной иммерсии).

П р и м е ч а н и е: Иногда числовую апертуру оптической системы записывают как: NA, подчеркивая необходимость учета наличия иммерсионной среды с показателем преломления N.

При правильной настройке микроскопа диаметр раскрытия полевой диафрагмы должен совпадать с полем зрения окуляра или незначительно превышать его. Апертурная диафрагма должна открываться по размеру зрачка объектива, для повышения контраста рекомендуется прикрывать ее до 2/3 диаметра зрачка.

Таким образом, достигаются необходимая равномерность освещения, минимизация рассеянного света и качество изображения, обеспечивающие правильную передачу структур исследуемого объекта. Освещение по Келеру в упрощенном варианте выполнено таким образом, что все элементы системы: источник света, коллектор, узел ирисовой полевой диафрагмы и конденсор, расположены на одной визирной оси под предметным столиком; фонарь при этом отсутствует. В осветительной системе моделей микроскопов, предназначенных для рутинных работ и обучения, полевая диафрагма отсутствует.

В качестве источника света, кроме галогенных ламп различной мощности от 20 до 100 Вт, в последнее время применяют светодиоды (LED). Светодиодные источники света характеризуются белым свечением с высокой цветовой температурой ~5000-6000 К и большим сроком службы ~20000 ч.

Освещение по методу тёмного поля

Освещение по методу темного поля применяется для исследования прозрачных объектов невидимых в микроскопе при обычном освещении по методу светлого поля. Объектами исследования могут быть спирохеты, дрожжи, бактерии, диатомовые водоросли, частицы коллоида.

Метод заключается в создании условий освещения, при которых в объектив микроскопа попадают лишь рассеянные (диффузно отражённые) от объекта лучи. Для этих целей применяются конденсоры с числовой апертурой, превышающей апертуру объектива, при этом лучи света, выходящие из конденсора, не попадут в объектив, и в отсутствии объектов в поле зрения микроскопа темно. При наличии объектов свет, отраженный от них, собирается объективом, и на темном фоне поля зрения микроскопа образуется изображение светящихся мелких элементов объекта. У более крупных структур видны только светлые контуры.

При освещении по методу темного поля:

 усиливается видимость слабо поглощающих или рассеивающих структур;

 могут быть видимыми структуры слишком мелкие для разрешения по законам оптики.

Однако следует отметить, что при этом методе освещения по виду изображения нельзя определить, прозрачны частицы или непрозрачны, больший или меньший показатель преломления они имеют по сравнению с окружающей средой. Кроме того, по изображению нельзя также сделать заключение об истинном виде и форме элементов структуры.

Фазовый контраст

Исследование в проходящем свете прозрачных, слабо поглощающих и невидимых при обычном освещении объектов возможно с применением устройства фазового контраста.

Принцип действия устройства основан на применении метода преобразования фазового сдвига лучей, возникающего при их прохождении через прозрачный объект и невидимого глазу, в амплитудное изменение, заметное для глаза. Преобразование осуществляется с помощью системы специальных диафрагм, устанавливаемых в плоскости выходного зрачка объектива и в сопряженной с ней плоскости апертурной диафрагмы конденсора. В конденсоре помещаются диафрагмы в виде светлого кольца (световые диафрагмы), а в объективе  диафрагма в виде затемненного кольца (фазовая). Устройство фазового контраста включает в состав комплект фазовых объективов разных увеличений и специальный конденсор со сменными световыми диафрагмами для объективов.

Люминесценция

Одним из методов исследования в микроскопии, получивших широкое распространение, является фотолюминесценция, позволяющая выполнять экспресс-диагностику с высокой степенью чувствительности.

Фотолюминесценция (флюоресценция) возникает под действием электромагнитного излучения в видимой или ультрафиолетовой области спектра и позволяет определять химический состав в отдельных элементах структуры объекта, их химические и структурные превращения. Излучение флюоресценции, определяемое свойствами вещества, характеризуется спектральным составом, степенью поляризации, квантовым выходом. По закону Стокса спектр излучения смещен в длинноволновую область по отношению к спектру возбуждения. Ряд объектов (нуклеиновые кислоты, нуклеотиды, ароматические кислоты белков, пигменты, в частности хлорофилл), обладают собственной флюоресценцией и светятся под действием излучения. Большинство исследуемых объектов светятся после обработки специфическими красителями (флюорохромами). Ткани, кажущиеся в обычном освещении неразличимыми, под воздействием специфического красителя могут быть дифференцируемыми.

Освещение объектов в люминесцентном микроскопе осуществляется светом, падающим сверху через объектив. Такая схема выгодно отличается от освещения проходящим светом, так как роль конденсора в этом случае выполняет объектив, обладающий большей светосилой. Кроме того, при варианте верхнего освещения не регламентируется толщина препарата.

Проблема энергетики для люминесцентного микроскопа очень значима, так как квантовый выход флюоресценции объектов, как правило, мал, и, поэтому, требуются яркие источники света и объективы с повышенной числовой апертурой.

В данном разделе приведены в очень кратком изложении основные сведения о микроскопе, его свойствах и конструктивных узлах. Методика настройки и управление рукоятками конкретного микроскопа излагается в документации, прилагаемой к нему. Перед началом работы на микроскопе необходимо внимательно ознакомиться с документацией и для правильной настройки выполнять рекомендации фирмы-производителя.


Доступ ограничен: Купить подписку